应用新型荧光显微技术研究循环癌细胞和TGF-β在成纤维细胞分化中的作用

【摘要】第一部分应用活体流式细胞仪技术研究前列腺癌细胞转移以及巨噬细胞对循环前列腺癌细胞的作用肿瘤转移是一个非常复杂的多步骤过程,也是导致癌症患者低存活率的原因。在肿瘤转移过程中,癌细胞首先需要脱离肿瘤的原发灶,然后侵入周围的血管或淋巴管中,随着血液或淋巴液迁移到体内的其他区域并进一步形成转移灶。由于血液循环系统贯穿全身,所以通过血循环的癌细胞可能在身体的任何部位建立新的转移灶。在本研究中,我们使用新兴的活体流式细胞仪技术来研究前列腺癌细胞的转移潜能与其在循环系统中消逝动力学之间的关系。活体流式细胞仪能够在体地对小动物体内的循环荧光标记细胞的数目和流动特性进行检测和定量。我们发现,恶性程度较高的前列腺癌细胞系PC-3比LNCaP能更快地从循环系统中消逝。在尾静脉注射前列腺癌细胞后的第1小时的时刻,超过70%的PC-3从循环中消逝了,相比之下,只有不到30%的LNCaP从循环中消逝了。激光共聚焦显微成像显示,在注射前列腺癌细胞后的第1和第5小时的时刻,小鼠颅骨下的骨髓区域中的DiD标记PC-3数量明显多于DiD标记LNCaP细胞。前列腺癌细胞的小鼠动力学差异可能会为我们研究前列腺癌的早期转移提供新的视角。巨噬细胞可能直接参与肿瘤的进展与转移,但目前人们对巨噬细胞是如何影响循环肿瘤细胞的转移过程尚不完全清楚。我们利用活体流式细胞仪研究了循环前列腺癌细胞在小鼠体内的消逝过程,以及通过脂质体包裹的氯膦酸二钠清除巨噬细胞后的循环前列腺癌细胞消逝动力学的改变情况。实验结果显示在巨噬细胞被清除的小鼠(实验组)和正常小鼠(对照组)中分别通过尾静脉注射前列腺癌细胞PC-3后,循环PC-3细胞在实验组和对照组中的消逝动力学是不同的。相比对照组,巨噬细胞被清除的实验小鼠体内的循环PC-3细胞在血液循环中的消逝速度较慢。该消逝动力学的差异意味着清除巨噬细胞将有助于前列腺癌细胞在循环系统中停留更长的时间。此外,通过体外成像实验我们发现巨噬细胞可以捕获,吞噬和消化PC-3细胞。因此,巨噬细胞的吞噬作用可能是导致循环肿瘤细胞的消逝动力学改变的一个重要原因。我们的方法对研究小动物模型中的巨噬细胞与肿瘤转移的关系有重要裨益。第二部分应用双光子荧光显微成像技术和生物图像信息学方法研究胶原蛋白支架中成纤维细胞的TGF-β分子信号通路为了进一步学习新的荧光显微成像技术,本人受国家留学基金委的资助,于2010年11月开始,前往世界著名学府美国麻省理工学院的PeterT.C.So教授实验室,开展了为期18个月的科学研究。细胞通过信号转导通路,蛋白质级联反应和各种小分子来感受外界环境并作出相应反应。目前大部分细胞信号通路知识都是通过经典的生化和遗传学操作得来的,但是随着所研究生物系统的复杂性不断增加,要求人们开辟更多新方法来研究细胞通路并加速实验进度。双光子荧光显微成像技术具有高分辨率、穿透能力强、光损伤小的优点,因此被广泛地应用于生物活细胞和组织的长时间三维成像。生物图像信息学方法通过综合细胞的基因操作,大规模成像,图像处理和统计学来研究细胞中复杂的信号转导通路,进而揭示相关的生理过程及药理作用机制。生物图像信息学现已被用于研究培养在传统二维培养皿中的细胞的生物问题。成纤维细胞在伤口愈合和许多纤维化的疾病中起重要作用。TGF-β调节成纤维细胞分化过程并影响细胞的形态和细胞-细胞外基质的相互作用,TGF-β诱导的信号通路会影响伤口牵拉和瘢痕形成,进而显著影响受伤器官中伤口愈合的效果。多孔胶原蛋白支架作为组织的细胞外基质类似物被成功应用在临床上对受伤器官进行诱导性再生过程。我们通过慢病毒介导的shRNA对成纤维细胞的TGF-β/SMAD信号通路中的各个成分进行干扰,并应用实验室搭建的16-通道光谱多(双)光子荧光显微镜,结合新的针对细胞-细胞外基质三维系统的生物图像信息学方法,来研究植于多孔胶原蛋白支架中的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞过程中TGF-β信号通路。通过对成纤维细胞的基于单细胞形态学以及细胞-多孔胶原蛋白支架系统的双光子荧光显微成像数据的处理和统计分析,并通过生化免疫印迹实验作为辅助验证手段,我们推断出：相对于TGF-β3,TGF-β1在介导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞过程中发挥着更重要的作用；SMAD1和SMAD3在TGF-β1介导的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞过程中发挥重要作用；SMAD1和SMAD3是通过不同的方式在TGF-β1介导的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞过程中发挥作用的。这些推测与其他文献中通过生化或遗传方法得到的结果是非常吻合的。因此,我们这里所建立的基于双光子荧光显微成像技术和生物图像信息学方法能很好地应用于研究细胞-细胞外基质(三维支架)中的信号转导问题,从而优化实验方案并加快研究进度。
【作者】郭进；
【导师】魏勋斌；
【作者基本信息】复旦大学，化学生物学，2013，博士
【关键词】活体流式细胞仪；癌症转移；循环肿瘤细胞；前列腺癌；活体共聚焦成像；巨噬细胞；脂质体包裹的氯膦酸二钠；双光子荧光显微成像；生物图像信息学；shRNA；TGF-β；SMAD；成纤维细胞；肌成纤维细胞分化；多孔胶原蛋白支架；

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